科研服务
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形态病理平台
免疫组化、免疫荧光
仪器型号：
Hitachi Regulus8100，Sigma 300；Zeiss Gemini 300； Hitachi S4800；JSM-7800F；蔡司 Supra 55等
预约次数：
56352次
服务周期：
平均5.0个工作日
13674980622项目介绍
1、免疫组化
是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术（ immunohistochemistry，IHC）。
2、免疫荧光
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术（ immunohistochemistry，IHC）。
2、免疫荧光
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
样本要求
免疫组化染色/免疫荧光染色送样要求：
1.包埋：石蜡包埋、OTC包埋。
（1）标本要求：已固定在4％多聚甲醛中的动物组织，或已固定在FAA中的植物组织。
（2）送样要求：
a. 动物组织：处死动物后立即取材，生理盐水冲洗表面，4%的多聚甲醛固定，一般组织固定48h左右进行包埋最好，大小不超过1cm*1cm*0.5cm，装组织的管子一定要比组织大，固定液是样品体积的5倍以上，以保证充分固定，封口膜封好避免运输过程中固定液洒出。
注：常温或少量冰袋运输。
2.切片：石蜡切片、冰冻切片。
（1）标本要求：已包埋的动物。
（2）送样要求：
a. 石蜡包埋的组织：冰袋运输。
b. OTC包埋的组织：干冰运输。
3.染色:
a. 石蜡切片：脱蜡至水、抗原修复、血清封闭、一抗孵育、二抗孵育、染核、脱水、透明、封片。
b. 冰冻切片：清洗去除OTC、血清封闭、一抗孵育、二抗孵育、染核、脱水、透明、封片。
（1）标本要求：切片。
（2）送样要求：
a. 石蜡切片：石蜡切片码齐装在塑料切片盒中，冰袋运输。
b. 冰冻切片：冰冻切片码齐装在塑料切片盒中，干冰运输。
4.拍照：普通荧光拍照、荧光数字扫描、激光共聚焦（免疫荧光可拍摄）。
（1）标本要求：已染色的切片。
（2）送样要求：已染色的切片，常温或少量冰袋运输。
1.包埋：石蜡包埋、OTC包埋。
（1）标本要求：已固定在4％多聚甲醛中的动物组织，或已固定在FAA中的植物组织。
（2）送样要求：
a. 动物组织：处死动物后立即取材，生理盐水冲洗表面，4%的多聚甲醛固定，一般组织固定48h左右进行包埋最好，大小不超过1cm*1cm*0.5cm，装组织的管子一定要比组织大，固定液是样品体积的5倍以上，以保证充分固定，封口膜封好避免运输过程中固定液洒出。
注：常温或少量冰袋运输。
2.切片：石蜡切片、冰冻切片。
（1）标本要求：已包埋的动物。
（2）送样要求：
a. 石蜡包埋的组织：冰袋运输。
b. OTC包埋的组织：干冰运输。
3.染色:
a. 石蜡切片：脱蜡至水、抗原修复、血清封闭、一抗孵育、二抗孵育、染核、脱水、透明、封片。
b. 冰冻切片：清洗去除OTC、血清封闭、一抗孵育、二抗孵育、染核、脱水、透明、封片。
（1）标本要求：切片。
（2）送样要求：
a. 石蜡切片：石蜡切片码齐装在塑料切片盒中，冰袋运输。
b. 冰冻切片：冰冻切片码齐装在塑料切片盒中，干冰运输。
4.拍照：普通荧光拍照、荧光数字扫描、激光共聚焦（免疫荧光可拍摄）。
（1）标本要求：已染色的切片。
（2）送样要求：已染色的切片，常温或少量冰袋运输。
结果展示
1、免疫组化：
2、免疫荧光：
2、免疫荧光：
常见问题
1、免疫组化产生组织切片非特异性染色的原因
a. 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条；
b. 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；
c. 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
d. 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
e. DAB孵育时间过长或浓度过高；
f. PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；
g. 标本染色过长中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。
b. 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；
c. 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
d. 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
e. DAB孵育时间过长或浓度过高；
f. PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；
g. 标本染色过长中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。
2、免疫组化背景过深的原因
可能是一抗浓度高；需要调整DAB孵育时间；考虑血清封闭的时间是否过短；适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。
3、用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白两者有何不同？
只是固定方法不同。细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。
4、间接法免疫荧光染色如何设置对照？
最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照，看是否非特异性染色，具体包括：
（1）空白对照：如果你做的是石蜡切片免疫组化，这个对照必须有，目的是看自发荧光，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。
（2）阴性对照：标本直接滴加二抗，呈阴性反应。
（3）抗原对照：标本加同种动物的未免疫血清，以 PBS 冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。
（1）空白对照：如果你做的是石蜡切片免疫组化，这个对照必须有，目的是看自发荧光，脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。
（2）阴性对照：标本直接滴加二抗，呈阴性反应。
（3）抗原对照：标本加同种动物的未免疫血清，以 PBS 冲洗后，在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。
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