一、项目介绍

　　激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy，简称LSCM)是近代生物医学图象仪器，是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针。该仪器利用计算机、激光和图像处理技术获得细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。该仪器作为目前最先进的分子细胞生物学的分析仪器，主要用于观察活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化、定量分析以及实时定量测定等。

　　二、工作原理

　　激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，激光扫描共聚焦显微镜光路图采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面逐点、逐行、逐面快速扫描成像。

　　扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点，通过控制调焦深度，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示所观察表面的立体结构

　　三、LSCM与荧光显微镜的区别

　　荧光显微镜：当成像面较厚，焦面上方下方的干扰信号都会被观察到，影响实验结果，因此荧光显微镜只能观察静态的亚细胞结构。

　　LSCM：是在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机控制来进行数字化图像采集和处理的系统。可以观察亚细胞层次的一些生化变化，是目前最先进的分子细胞生物学的分析仪器。

　　优势：LSCM比普通荧光显微镜获得更高对比度、高分辨率图像，同时具有高灵敏度，对检测样品无损伤、可靠和优良重复性。LSCM具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时可观察并可形成清晰的三维图像等优点，能比宽场看到的成像面更薄，更清晰，在较以往更短的采集时间内轻松实现超高分辨率更大观察视野成像。

　　四、LSCM的应用范围

　　LSCM应用广泛，在生命科学、医学研究中日益受到重视。一方面可以观察细胞或亚细胞形态结构等研究，如检测蛋白质、抗体及其他大分子;检测细胞凋亡;细胞器的观察和测定(线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体);检测细胞融合;观测细胞骨架;检测细胞间隙连接通讯;检测细胞或组织内脂肪;进行细胞或组织结构的三维重构等。同时，LSCM还可以进行活体细胞或组织功能的实时动态检测，如测定细胞内钙变化;测定细胞PH 变化;检测膜电位变化;药物筛选、检测荧光漂白恢复等。除此之外，LSCM在交叉学课中的高分辨率成像，如神经科学、药理研究、材料研究、化工原料等也广泛应用。

　　五、LSCM经典案例
         

Live/Dead染色                    成骨细胞骨架(红色)与核(蓝色)染色            线粒体与荧光探针的共定位                           细胞内ROS

            

　　免疫荧光染色                 大肠杆菌表面吸附噬菌体(超分辨)   金黄色葡萄球菌细菌膜多糖染色(超分辨)                     皮克林乳液

            

水包油乳液                               软骨细胞三维生长                                         细胞骨架                                      生物膜

　　六、测试注意事项

　　(一)样品邮寄

　　1、细胞/细菌/污泥类样本

　　①细胞：冻存的细胞;25平方厘米培养瓶长到70%加满培养基室温固定好寄送

　　②细菌：菌液5000 rpm离心10 min，于1.5 mL离心管中得到绿豆大小沉淀，寄送沉淀。细菌类需要死活染色/ROS染色的，一般加冰袋泡沫盒4度保存，样品不和冰袋接触。

　　③蛋白/多糖类：样本加冰袋泡沫盒4度保存或者2.5%的戊二醛固定4度保存，样品不和冰袋接触。

　　④污泥类：样本如果太厚，可以进行冷冻切片，具体请和工作人员沟通。2、植物类样本

　　① 直接拍摄：样品长宽不超过20mm，高不超过10mm;或直径不超过10mm，厚度不超过5mm，一定标出测试面。一般加冰袋泡沫盒4度保存，样品不和冰袋接触。

　　②制样后拍摄：可进行简单冰切及刀切，软化等。样本准备好后加冰袋泡沫盒4度保存，样品不和冰袋接触。3、生物膜类样本

　　①金属/瓷砖/岩石等块体类：建议长宽高尺寸不超过1 cm，且均要求样品表面平整，需要标出拍摄面(测试面起伏<200um);

　　②薄膜类：直径尺寸不超过2 cm，一般加冰袋泡沫盒4度保存，样品不和冰袋接触;

　　③若在爬片上培养生物膜，可将爬片粘于培养皿底部，充满培养基，封口膜密封完全，再4度保存。

　　4、提供清楚激发/发射波长，拍摄倍数等要求信息;若需要染色，需要注明染色剂种类，标明染料名称和拍摄条件(激发/发射波长)

　　备注：若做细胞摄取实验或其他亚细胞器的定位实验时，要求样品自带荧光。

　　5、细胞类样品直接拍摄，需要封片后常温避光邮寄。

　　6、固体类直接拍摄样品建议长宽不超过20mm，厚度不超过10mm，重量不超过10g，一定标出测试面。注：以上送样条件仅做参考，具体送样与实验目的和要求相关，具体请联系e测试工作人员。