一、外泌体概述

　　外泌体(Exosome)：由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-150 nm，密度在1.13-1.21g/ml，具有杯状形态、脂质双分子层结构。天然存在于血液、尿液、脑脊液、胆汁、乳液、唾液、汗液和细胞培养基等生物体液中，包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞(免疫细胞、神经细胞、干细胞)，都可以产生并释放exosome。

　　功能：(1)外泌体可为胞间通讯提供生物活性大分子(如蛋白质、脂质和核酸等)，并参与细胞间信息传递;(2)可调节多种生理或病理反应，包括血管生长、肿瘤细胞侵袭与转移、免疫应答、神经退行性疾病等。

　　二、外泌体提取方法及优缺点

　　目前有6种常见提取方法：超速离心法、沉淀法、分子筛层析法、密度梯度离心法、膜超滤法、膜特异性吸附法

　　三、外泌体鉴定及结果展示

　　根据国际细胞外囊泡学会(ISEV)在2014年的提议，外泌体的鉴定主要有三种形式：透射电镜(TEM)、粒径分析( NTA)、蛋白标志物(WB)。

　　1、外泌体形态

　　透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，简称TEM)，可以看到在光学显微镜下无法看清的小于0.2um的细微结构，这些结构称为亚显微结构或超微结构。双层囊膜结构(亚显微结构)是外泌体重要标志之一，所以透射电镜作为外泌体表征检测方式之一，可以很好的拍出外泌体双层囊膜结构，用来观察外泌体形态。

　　2、外泌体粒径及浓度

　　通过纳米颗粒示踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis，简称NTA)技术，可以对30-1000nm范围内的纳米颗粒进行快速实时动态检测，可对抽提获得的外泌体进行粒径大小及数量进行统计，以及初步质量评估。该技术易用、快速、稳健、准确，是对现有外泌体鉴定方法的一个良好补充。我司所使用的仪器是德国ParticleMetrix公司所生产的Zetaview-PMX120-Z。

　　3、外泌体表面标志物

　　Western blot(WB)是通过抗原抗体特异性结合的原理，对外泌体标志蛋白进行检测，从蛋白质层面对外泌体进行鉴定。常用的外泌体标志蛋白包括CD63、TSG101及Alix等。

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　　四、常见问题

　　1、外泌体样品如何保存?

　　长期保存，置于-80℃。冻存前，离心去除细胞和细胞碎片，再将样品分装保存在-80℃。如果条件允许，建议用新鲜样品进行外泌体的分离和后续实验，短期保存(1-2天)，置于4℃(确保无菌)。

　　2、外泌体电镜是不是一定要有膜结构，无膜结构的球体是外泌体吗?

　　负染电镜结果中外泌体的形态是那种明显的茶托样或者大饼样的，边缘有一圈略微更明亮的亮圈。如果结构是没有膜结构的圆球形，那么很可能看到了脂蛋白颗粒或者抱团的蛋白质。

　　3、外泌体负染色应该如何提供样本?

　　样品悬液尽量纯化，提供100-200μl，合适的上机浓度(上机前直接滴加样品，不做稀释或浓缩)。

　　4、一般需要提供多少细胞培养液提取外泌体?

　　培样液提供量取决于细胞系。有些细胞系外泌体释放量高，几毫升即可;有些释放量低，需要上百毫升。一般来说一个普通的细胞系，用超离分离外泌体，第一次摸索条件，起始培液量最好50ml以上。