一、简介

　　蛋白免疫印迹(Western Blot，简称WB)是一种能够从细胞或组织提取的复杂蛋白质混合物中检测靶蛋白并对其进行半定量的常用实验技术，还可以鉴定和定量蛋白质中翻译后修饰的氨基酸。与蛋白质科学中其他常用的分析技术(如ELISA、IHC、质谱法和显微镜观察等)相比，WB可提供有关蛋白质分子量信息，区分分子量相近的蛋白，适合检测低丰度蛋白和同时检测多个目的蛋白，并在蛋白质纯化或评估细胞中蛋白质表达水平时具有一定的优势。该方法广泛应用于分子生物学、生物化学、免疫遗传学等分子生物学领域。

　　二、原理

　　WB利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)，将抗体作为探针，标记的二抗作为显色工具，来分离指定样品中包含的各种蛋白质。将分离的蛋白质样品转移到固相载体(如硝酸纤维素或PVDF 膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。接下来，将膜与对感目标蛋白质的特异抗体一起孵育。在洗膜过程中，未结合的抗体被洗掉，只留下与目标蛋白质结合的抗体，最后通过显影胶片或荧光扫描来检测结合的抗体。

　　根据原理，蛋白免疫印迹可分为两种方法：直接法、间接法。

　　表1. 两种方法的优缺点

　　三、应用

　　1、检出样本中的目标蛋白质;

　　2、定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况;

　　3、用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。

　　四、实验流程

　　1、蛋白样品的制备

　　(1)细胞总蛋白的提取：

　　①收集细胞，加入适量的预冷的PBS洗涤细胞，然后弃去洗液，重复上述步骤三次。收集细胞沉淀放置于冰上。

　　②向细胞沉淀种加入含有PMSF的100 μl裂解液，在冰上的裂解30分钟。在裂解过程中，要定期轻轻弹动以确保细胞充分裂解。

　　③收集裂解液到1.5 ml 离心管中，在4℃下进行12000 rpm离心5分钟。

　　④将离心后的上清分装至0.5 ml 离心管中，将样品于沸水中煮5 min使蛋白变性，迅速转移到-20℃保存。

　　(2)组织中总蛋白的提取：

　　①取少量组织块，使用清洁的剪刀将组织块彻底剪碎。

　　②向匀浆器中加入500 ul含有PMSF的裂解液，进行匀浆。随后将匀浆器置于冰上。

　　③5-10分钟后，再次进行碾磨，然后再次放置于冰上。这个过程需要重复几次，以确保组织块充分碾碎。

　　④裂解30分钟后，使用移液器将裂解液转移至1.5 ml 离心管中。随后，在4℃下进行12000 rpm离心5分钟，将上清液分装至0.5 ml 离心管中，将样品于沸水中煮5 min使蛋白变性，并存放于-20℃。

　　2、蛋白含量的测定

　　使用BCA试剂盒进行蛋白含量测定—BCA测定方法如下：

　　① 标准曲线的绘制;

　　② 根据样品数量，按 BCA 试剂 A ：BCA 试剂 B(50:1)配制适量 BCA 工作液，充分混匀;

　　③各孔加入 200μL BCA 工作液;

　　④把酶标板放在振荡器上振荡 30sec，37℃放置 30 min，然后在 562nm 下比色测定。以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线;

　　⑤稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为 20μL，加入 BCA 工作液 200μL，充分混匀，37℃放置 30 min后，以标准曲线 0 号管做参比，在 562nm 波长下比色，记录吸光值;

　　⑥ 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量(μg)，除以样品稀释液总体积(20μL)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单位：μg/μL)。

　　3、SDS-PAGE电泳

　　① 清洗玻璃板：蒸馏水清洗玻璃板，晾干后使用;

　　②灌胶与上样：配置好分离胶和浓缩胶后，插入梳子，待浓缩胶凝固后，将梳子轻轻拔出。

　　③上样：计算合适的上样量后，每个孔的上样量保持一致，

　　④ 电泳：电泳时间一般为3～5小时，电压为40 V或60 V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，准备进行转膜。

　　4、转膜

　　杂交膜的选择是决定 Western blot 成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。将胶转移到PVDF膜上，进行电转移，电转移一般使用60 V转移2小时或40 V转移3小时。

　　5、膜封闭和抗体孵育

　　①移至含有封闭液的平皿中，室温下在脱色摇床上摇动1小时，再用TBS洗3次，每次10分钟。

　　②将配好的一抗抗体，加入对应的膜上，4℃过夜孵育。

　　③将一抗孵育的膜恢复室温后，再用TBS洗3次，每次10分钟，将对对应的二抗抗体，室温孵育1-2小时，再用TBS洗3次，每次10分钟。

　　6、化学发光

　　发光液(A液：B液)1：1配置(注意避光)，用移液器吸取合适量的发光液至覆盖PVDF膜，ECL发光仪上曝光并采集图像。

　　五、结果展示

　　六、常见问题

　　1、Western blot为什么背景模糊?

　　2、样品要如何准备?

　　① 新鲜样品：1、0.1g新鲜组织(至少)2、加入蛋白裂解液，干冰运输;

　　② 细胞：细胞类型样本细胞数为1*106以上)，干冰运输;

　　③ 对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。加入裂解液前，尽量将组织剪成小块。

　　④ 需提供待测样品的一抗及其说明书(一抗一般为10μl左右，也可由平台代购);其他所涉及的细胞、试剂盒以及生物耗材均可由本平台均有偿提供。

　　3、为什么条带会出现弥散?

　　4、常规两种封闭液应用场景有什么不同?

　　常规两种封闭液是脱脂奶粉和 BSA。

　　①脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素。如果封闭剂中含磷酸酶，磷酸酶与印记膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化，所以检测磷酸化抗体时，不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭剂。

　　②所以一些磷酸化抗体一般使用 BSA进行封闭，一些其他抗体使用BSA进行封闭后，可能会产生比脱脂奶粉更强的信号。

　　5、测试背景有白色/黑色斑点?

　　①转膜时有气泡或抗体分布不均，实验时尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动;

　　②抗体与封闭剂结合，过滤封闭剂。